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    公开号:WO1988006182A1
    申请号:PCT/JP1988/000136
    申请日:1988-02-10
    公开日:1988-08-25
    发明作者:Kazue Oishi；Tadashi Maruyama；Masanobu Sugomoto；Yoshiyuki Sagata；Yoji Ikawa
    申请人:Toa Nenryo Kogyo Kabushiki Kaisha；Rikagaku Kenkyusho；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 組換ワ ク チニァ ウ ィ ルスを用いたゥ シ白血病ウ ィ ルス ワ ク チ ン 技術分野
    [0002] こ の発明はゥ シ白血病ウ ィ ルスの表面抗原遺伝子を舍有す る組換ワク シニアウ ィ ルス及びその製造方法並びにその使用 方法に関する。 背景技術
    [0003] ゥ シ白血病ウ ィ ルス （ B L V ) は、 地方病性ゥ シ白血病 ( E B L ) の原因となる ウ ィ ルスで感染牛の一部は腫瘍化し 致死的経過をたどる。 また、 無症状であっても感染牛の血液 は生涯感染性を持ち続けて感染源となる。 これまで、 E B L のヮ ク チ ンは開発されてお らず、 感染阻止のための ヮ ク チ ン の開発が望まれる。
    [0004] ワ ク シニア ウ イ ルス は従来、 種痘ワ ク チ ン用ウ イ ル'ス と し て使用されて き た力く、 今日 ではワ ク シニア ウ ィ ルスに種々 の 病原体、 特に病原ウ ィ ルス の抗原遺伝子を組み込んで組換ヮ ク シニア ウ ィ ルスを作製し、 こ の組換ワ ク シニア ウ ィ ルスを 生ワ ク チ ン と して使用する試みが種々 行われている 。 し力、し ながら、 このよ う な手法によるゥ シ白血病ワ ク チ ンの開発は まだ行われていない。
    [0005] B L V遺伝子はすでに同定され、 全構造が決定されている in. Sagata 等、 Proc. ^fatl . Acad. Sci . 82= 677-681 (1985) ) 。 しかしながら、 この遺伝子の内ウ ィ ルス表面蛋白 質（BLV- env) をコー ドする遺伝子（env遺伝子〉 を切り出し、 これを人為的に発現せしめる方法は示されていない。 B月の開示
    [0006] 従って、 この発明は、 ワク シニアウィ ルス遺伝子中にゥ シ 白血病ウ ィ ルスの表面抗原遺伝子が組み込まれているゥ シ白 血病ウ ィ ルス ワ ク チ ン及びその製造方法、 並びにその使用方 法を提供しょう とする ものである。
    [0007] さ らに詳し く は、 本発明は、 ワク シニアウ ィ ルス遺伝子に ゥ シ白血病ゥィルスの表面抗原遺伝子が組み込まれており、 ゥシ白血病ゥィ ルスの表面抗原を発現することができる組換 ゥ ィ ルスを提供する。
    [0008] 本発明はさ らに、 該組換ウ ィ ルスの製造方法であって、
    [0009] (1) ヮ ク シニア ゥ ィ ルス遺伝子由来のへマグルチ二 ン遺伝子 を含有する D N A断片をク ローニングべクタ一に挿入してへ マグルチ二ン遺伝子含有べクタ一を用意し ；
    [0010] (2) 前記へマグルチニン遺伝子含有べクター中のへマグルチ ニン遺伝子中に、 - ゥ シ白血病ウ ィ ルスの表面抗原遺伝子及び 該遺伝子のためのプロモーターを挿入してゥシ白血病ウイ ル スの表面抗原遺伝子含有べクタ一を調製し ； そして
    [0011] (3) 前記表面抗原遺伝子舍有べク タ一中のへマグルチ二ン遺 伝子領域と、 ワ ク シニア ウ ィ ルス遺伝子 (Γ>へマグルチニン遺 伝子領域との間の相同性組換により該ヮク シニアウイルス遺 伝子のへマグルチニ ン遺伝子領域に前記ゥ シ白血病ウ イ ルス の表面抗原遺伝子を該遺伝子のためのプロモーターと共に組 み込む ；
    [0012] 段階を含んで成る方法を提供する。
    [0013] 本発明はさ らに、 前記組換ウ ィ ルスを哺乳動物に接種し、 ある いはさ らに、 不活性化されたゥ シ白血病ウ ィ ルス又は抗 原性を有するその部分を接種するこ とを特徴とする、 ゥ シ白 血病ウ ィ ルスに対して ヒ ト以外の哺乳類を免疫する方法を提 供する。 図面の簡単な説明
    [0014] 第 1 図はへマグルチ二ン遺伝子を舍有するプラ ス ミ ド PH U3 の作製方法を示す。
    [0015] 第 2図はへマグルチニ ン遺伝子の構造を示す。
    [0016] 第 3図は 7. 5 K蛋白質プロ モ ー タ ー塩基配列を示す。
    [0017] 第 4図は 7. 5 K蛋白質プロ モ ー タ ー の化学合成における D N A断片の塩基配列を示す。
    [0018] 第 5図は 7. 5 K蛋白質プロ モーターを舍むプラ ス ミ ド P9— 7. 5 Psの作製方法を示す。
    [0019] 第 6図は BLV- env 遺伝子を舍有するプラ ス ミ ド pl3-Beの作 製方法を示す。
    [0020] 第 7図は、 7. δ Κ蛋白質プロモータ一及び BLV-env 遺伝子 を含有するプラス ミ ド P9— 7. 5 ps— Be、 並びにへマグルチ二 ン遺伝子中に 7. 5 K蛋白質プロモータ一及び BLV- env 遺伝子 が挿入されたプラ ス ミ ド pl3- HA - 7. 5 Ps - Beの作製を示す。 第 8図はワ ク シニア ウ ィ ルス L0-1株とプラ ス ミ ド P13— — 7. 5 Bs - Beとの組換による組換ヮク シニアウイルスの作製 及びそのス ク リ ーニングの方法を示す。
    [0021] 第 9図は組換ワクシニアウ ィ ルス No.3、 及び No. 1 6 による BLV-en 遺伝子の棻現を示すゥ エスタ ン ' プロ ッ テ ィ ングの 図である。
    [0022] 第 1 0図は、 組換ワ ク シニアウ ィ ルス No. 1 6又は L 0 1 の 接-種の後、 不活性化 B L Vを接種したゥサギの血清中の抗体 の産生を示すウ ェスタ ン · プロ ッティ ングの結果である。
    [0023] 第 1 1 図は組換ワ ク シニア ウ ィ ルス No. 1 6 の接種の後、 不 活性化 B L Vを接種したゥサギの血清中の抗体の柽時的増加 を示すウ ェスタ ン . ブロ ッ テ ィ ングの結果である。
    [0024] 第 Γ 2図は A T I プロモータ ーを舍むプラ ス ミ ド pl8- ATレ pro536の作製方法を示す。
    [0025] 第 1 3図は A T I プロモーターを含むブラス ミ ド ρί2- 9 の 作製方法を示す。
    [0026] 第 1 4図はへマグルチニ ン遺伝子中に A T I プロ モー タ ー が挿入されているプラ ス ミ ド の作製方法を示す。
    [0027] 第 1 5図はへマグルチニ ン遺伝子中に A T I プロモーター 及び BLV- env遺伝子が挿入されている プラ ス ミ ド P9 - H A - AT I P- Be の作製方法を示す。
    [0028] 第 1 6図は BLV- env 遺伝子及び 7. δ Κ天 プ口モータ—を 舍有するプラ ス ミ ド P2401— 7. 5 Ρ Κ - Beの作製方法を示す。
    [0029] 第 1 7図はへマダルチュ ン遺伝子中に 7. 5 K天然プロモ ー タ一及び BL.V-env 遺伝子が揷入されているプラ ス ミ ド P13-HA- 7. 5 P N - Beの作製方法を示す。
    [0030] 第 1 8図は組換ワ ク シニア ウ ィ ルス No.16 (L01- 7. 5 Ps-Be) 組換ワ ク シニア ウ ィ ルス No. 1 O - 7. 5 P N -Be) N 及び組換ヮ ク シニアゥ ィ ルス No. 2 3 (m0- ATIP-Be)による BLV-env 遺伝子 の発現を、 Bい/ - en V 遺伝子を含有しないネガティ ブ対照（mO) 及びヒ ッ ジの B L V感染細胞 F L Kであるポジティ ブ対照と 比較して示すウ ェスタ ン · プロ ッティ ング図である。
    [0031] 第 1 9図は組換ワ ク シニア ウ ィ ルス No. 1 (itiO - 7. 5 P N -Be) をゥサギに接種した後 6週間目のゥサギ血清中の抗体を B L V ビ リ オ ンを抗原と してウ ェ スタ ン - プロ ッティ ングし た結果を示す。
    [0032] 第 2 0図は、 第 1 9図に言及したゥサギについて、 接種 1 4週間後に追加免疫を行つた直後及び 3週間後のゥサギ血 清中の抗体を B L V ビ リ オ ンを抗原と してウ ェ スタ ン · ブ口 ッテ ィ ング した結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
    [0033] ワ ク シニア ウ ィ ルス遺伝子に外来遺伝子を挿入する方法と しては、 挿入しょう とする外来遺伝子の両端にワク シニアゥ ィ ルス遺伝子中の特定の部位の配列を連結し、 こ の部位とヮ ク シニア ウ ィ ルス遺伝子中の対応配列との間の相同性組換に よる方法が一般に用いられ、 本発明においてもこ の方法を用 い る こ とができ る。 こ のよ う な外来遺伝子挿入部位は、 その 挿入により ウ イ ルス の増殖が本質的な影響を受けず、 しかも 外来遺伝子が挿入されたウ ィ ルスの簡単な同定を可能にする ような部位でなければならない。 本発明においては、 このよ うな部位としてへマグルチニン遺伝子中の部位を使用するの が好ましい。 へマグルチニンはワク シニアウイルスの増殖の ために必須ではなく 、 しかも外来遺伝子の揷入によりへマグ ルチニン遺伝子の機能が失われた場合、 そのよ う なワ ク シニ ァウイルスを血球凝集機能の喪失として同定することができ るからである。 この同定は、 ニヮ ト リ赤血球によるウ ィ ルス プラークの染色により簡単に行う ことができる。
    [0034] 1. へマグルチニ ン （ H A ) 遺伝子のク ロ ー 二ング （第 1図及び第 2図）
    [0035] へマグルチニ ン （ H A ) 遺伝子は、 ワ ク シニア ウ ィ ルス IHD-J 株の遺伝子の Hind IE A断片の右末端側に位置する Sal I — Hind M断片 （約 1. 8 kbp)中に含まれることが明らか にされ、 へマグルチ二ンコ一 ド配列を舍むこの断片の全 D N A配列が決定されている 〔H. Shida等、 Virology 150, 451-462 (1986) J 。 従って、 本発明においてはこの断片を使 用する のが便利である。
    [0036] こ の断片を、 ワ ク シニア ウ ィ ルスの Aから、 対応する 制限酵素、 例えば Hind i!及び Sal I により切り出し、 適当な ベクター中にク ローニ ングする。 このようなベクターとして は遺伝子操作において常用されている任意の細菌性べクタ一 例えば大腸菌（ E. col i ) プラ：、 ミ ドを使用することができ る。 このようなベクターとして、 例えば大腸菌プラス ミ ド PUC 又は PUC 9を使用することができる。 これらのプラ ス ミ ド pUC 13及び p C 9はク π—ニング用ベクターとして当業 界において広 く 使用されており 、 容易に入手する こ とができ る。
    [0037] pUC 13を使用する場合、 これを H i nd 1Π及び Sa I I によ り消 化し、 こ の大断片と、 前記のへマグルチニ ン遺伝子を含有す る 1. 8 kbp Hind i - Sa I I 断片とを連結して、 プラス ミ ド pHA 13を得る。 このプラス ミ ドを、 例えば E . コ リ JM 103 株に形質転換する こ とによ り 、 目的とするへマグルチニ ン ( H A ) 遺伝子を増幅する こ とができ る 。
    [0038] 7
    [0039] 2. ゥ シ白血病表面抗原（BLV- env) 遺伝子の ク ロ 一ニ ング （第 6 図）
    [0040] ゥ シ白血病ウ イ ルスのゲノ ム遺伝子がプラ ス ミ ド pBR 322 中に組込まれたプラス ミ ド （本明細書においてプラ ス ミ ド PBR 322-BLV と称する） はすでに造成されている 〔N. Saga t a 等、 Gene, 26, 1 - 10 (1983) 。 本発明においては、 一つの態 様と してこのプラ ス ミ ド力、ら .、 Pvu Π及び Xho I による この プラ ス ミ ドの切断、 及び Sma I によ る部分消化によ り 、 B v' - onv 遺伝子を含む D N A断片を得る こ とができ る 。 次にこれ を、 市販されているプラ ス ミ ド pCU 13の Sina i 部位に挿入す る こ とによ り プラス ミ ド Pl3- Beを得る こ とができ る。
    [0041] 3. 7. 5 K蛋白質遺伝子の合成プロモータ — を含むプラ ス ミ ド 13-HA- 7. 5 Ps-Be の
    [0042] 作製 （第 5 図及び第 7 図）
    [0043] ( 1 ) 7. 5 K蛋白質遺伝子のプロ モ ータ ー の ク ロ ー ニ ング 本発明の一つの態様においては前記 -env 遺伝子を発現 せ しめるためのプロモータ ー と して、 7. 5 K蛋白質遺伝子の プロモーターを用いることができる。 このプロモーターの塩 基配列はすでに決定されており 〔Venktesan: S. 等、 Cell, 25, -805-813 (1981) 、 これを化学的に合成することができる , 次にこ の合成 D N A断片をプラス ミ ド pCU 9 に挿入すること によりプラスミ ド p9— 1 ί. 5 Psを得る。
    [0044] (2) BLV-env 遺伝子と Ί. 5 K蛋白質遺伝子プロモ—ターと の連結
    [0045] 次に、 前記プラス ミ ド pl3- Be中の BLV- env 遺伝子と前記プ ラ ス ミ ド p9— 7. 5 Ps中の L 5 K蛋白質遺伝子のプロモーター とを連結する このためには、 pl3-Beを EcoR I 及び Hind HIで 切断することにより BLV-env 遺伝子を含有する D N A断片
    [0046] (約 2 kbp)を得、 末端を平滑化する。 他方プラ ス ミ ド P9 - 7. 5 Psを Xba I により切断した後末端を平滑化する。
    [0047] 次にこれを連結して、 7. 5 K蛋白質のプロモーター （ 7. 5 Kプロモーター） の下流に BLV- env 遺伝子が連結されている プラ ス ミ ド P9 - 7. 5 Ps - Beを得る。
    [0048] (3) 7. 5 Kプロ モ ータ ー及び Bいし env 遺伝子
    [0049] のへマグルチ二ン遺伝子中への挿入
    [0050] 次に、 前記プラス ミ ド P9 - 7. 5 Ps - Beを Acc I で切断し、 そして末端を平滑化することにより 7. 5 Kプロモーター及び BLV-env 遺伝子を舍有する D N A断片を得る。 他方、 前記プ ラ ス ミ ド pHA 13を cc I により切断した後、 末端を平滑化し これを連結することにより、 へマグルチ二ン遺伝子中に 7, 5 Kプロモーター及び BLV-env が挿入されているプラス ミ ド P13— M - 7. 5 Ps— Beを得る。 4. A型封入体 （ A T I ) 蛋白皙遺伝子のプロモ—
    [0051] タ ーを含有するプラス ミ ド P9— HA— ATIP— Be
    [0052] の作製 （第 12〜 16図）
    [0053] プロ モ ー タ ー と して牛痘ウ ィ ルスの A型封入体 （ A T I ) 蛋白質遺伝子のプロモータ ー （ A T I プロモータ —） を使用 し、 へマグルチ二 ン遺伝子中に A T I プロモータ ー と BLV-env 遺伝子が挿入されているプラス ミ ドを得る こ とができ る。
    [0054] (1) A T I プロモータ ーのク ローニ ンク"
    [0055] A T I プロモータ ーを舍有するプラ ス ミ ド pC 6 は牛痘ウ イ ルスから調製する こ とができ る。 このプラス ミ ドの調製法は 後で実施例 1 0 に記載する。 PC 6 を Sac I 及び BamH I によ り 切断し、 線状化プラス ミ ドをェキソヌ ク レア一ゼにより短縮 し、 末端を平滑化した後、 これを再連結して、 A T I の構造 遺伝子が除去されているプラス ミ ド P13C - 6 - 2 - 32を得る。 このプラス ミ ドを Taq I 及び EcoR I によ り消ィ匕して A T I フ。 口モータ ーを舍有する 0. 6 k bpの D N A断片を得、 これを pCU18 の H i nc Π部位に挿入する こ とによ り プラ ス ミ ド pl8— AT I — pro536を得る。 このプラ ス ミ ドにおいては、 A T I プロモー ター領域のす ぐ下流に A T Gが存在し、 これはこのプロモ— ターの下流に外来遺伝子を揷人する場合に不都合であるため M13 RFフ ァ ー ジを用いる突然変異の導入によ り A T Gを A T Aに変換し ·、 プラ ス ミ ド pA2- 9を得る。
    [0056] (2) A T I プロモータ ーのへマグルチニ ン遣伝子への揷入 前記のプラス ミ ド PA2-9を EcoR I 及び Hind EIによ り消化、 この末端を平滑化して A T I プロモ ータ ーを含有する断片を 得、 これを前に記載したへマグルチニン遺伝子を含有するプ ラス ミ ド pHA 13の Nru I 部位に挿入することにより、 へマグ ルチニン遺伝子中に A T I プロモータ一が挿入されたプラス ミ ド pHAA2- 9を得る。
    [0057] (3) プラス ミ ド PH 2-9への Bいし env 遺伝子の挿入
    [0058] 前記プラスミ ド pl3— Beを EcoR I 及び Hind IEにより消化し、 この末端を平滑化して BLV-env 遺伝子を含有する D N A断片 を得、 これを前記のプラス ミ ド ρΗΑΑ·2- 9の A T I プロモータ 一の下流の Sma I部位に挿入する ことにより、 へマグルチニ ン遺伝子中に A T I プロモーター及び BLV- env 遺伝子が揷入 されているプラス ミ ド p9— M— ATI P— Beを得る。
    [0059] 5. 7. 5 K蛋白質の天然プロモーターを含むプラス ミ ド P13-HA- 7. 5 P —Beの作製 （第 16図及び第 Π図）
    [0060] (1) 7. 5 K蛋白質の天然プロモーターのク ロ—ユング
    [0061] 7： 5 K蛋白質遺伝子のプ口モータ一はすでに記載されている (Venktesan, S. 等、 Cel 1 , 25, 805-813 (1981) 3 0 この記 載に従って該プロモーターを舍有する D N A断片を得、 これ を pCU 9 に挿入することによりプラス ミ ド p2401を得る。
    [0062] (2) BLV-env 遺伝子と 7, 5 K蛋白質天然プロモ—ター
    [0063] との連結
    [0064] 前記プラス ミ ド P13— Be中の BLV-env 遺伝子と前記プラス ミ ド p2 01中の 7. 5 K蛋白質遺伝子の天然プロモーターとを 連結する。 このために P13— Beを EcoR I 及び Hind ΙΠで切断す ることにより BLV- env: 遺伝子を舍有する D N A断片（約 2 kbP) を得、 この末端を平滑化する。 他方、 プラス ミ ド p2401を Sma I で切断し、 これに前記の EcoR I - H i nd EI断片を連結し て、 7. 5 K天然プロ モータ — と BLV- env 遺伝子が連結されて いるプラス ミ ド P2401 - 7. 5 P N — Beを得る。
    [0065] (3) 7. 5 K天然プロモータ —及び BLV- env 遺伝子のへマグ ルチニ ン遺伝子中への挿入
    [0066] 次に、 前記プラ ス ミ ド P2401 - 7. 5 P N ― Beを EcoR ΐ 及び Hind fflで切断し、 そ して未端を平滑化する こ とによ り 7. 5 K 天然プロモータ —及び Bい' - en V 遺伝子を含有する D N A断片 を得る。 他方、 前記プラ ス ミ ド PHA 13を Acc l によ り 切断し た後、 末端を平滑化し、 これを連結する こ とによ り 、 へマグ ルチニ ン遺伝子中に 7. 5 K プロ モ ータ ー及び BLV - en V が挿入 されているプラス ミ ド pl3— HA— 7. 5 P N — Beを得る。
    [0067] 6. 組換による ワ ク シニアウ イ ルス遺伝子へ の BLV. lenv遺伝子の揷入 （第 8 図） 最後に、 前記のよ う に して作製した組換用ブラス ミ ド Pl3-
    [0068] HA-7.5Ps-Be, p9 - H A - AT I P - Be , 及び 13 - H A - 7. 5 P N -Be を用いて、 これらのプラス ミ ド中に存在する BLV- env 遺伝子 を該遺伝子のためのプロモータ一と共にヮ ク シニアウ ィ ルス 遺伝子のへマグルチ二 ン遺伝子領域に組み込む。 この組換は- ワ ク シニア ウ ィ ルス遺伝子のへマグルチ ニ ン遺伝子領域と、 前記組換用プラス ミ ド中の BLV-env 遺伝子の両端に存在する へマダルチ ..一ン遺伝子部分との間の相同性組換によ って行わ れる。
    [0069] こ のための ワ ク シニア ゥ イ ノレス と しては , 種々 の ワ ク シ二 ァ ウ ィ ルス株を用いる こ とができ、 それらの若干の例と して
    [0070] o
    [0071] W R株、 し 0-5株、 LC16m0株、 LC16m8株等を挙げるこ とができ る。 LC16mO株及びし C16m8株は神径病原性の低い弱毒株として L 0株から得られたものであり、 これらは次のよう な性質を 有する。
    [0072] 第 1 表 し 0 し C16m0 し C16m8 増殖不能温度 > 41/C 41 4(K5。C
    [0073] (1TK細胞）
    [0074] ブラ ックサイズ 大 < 1
    [0075] 2 中 Φ
    [0076] (RK細胞）
    [0077] ポツクサイ ズ 大 中 小 各種細胞におけ
    [0078] る増殖性
    [0079] GAM 卅
    [0080] Vero細胞 卅 -H +
    [0081] 細胞
    [0082] CEF 細胞 -H-5 中枢神柽病原性
    [0083] 増殖性
    [0084] ゥサギ +
    [0085] サ ル
    [0086] マウ ス / /
    [0087] 侵入性
    [0088] マウ ス
    [0089] 皮膚増殖性
    [0090] ゥサギ +
    [0091] 0 ヒ ト
    [0092] 抗体産生能
    [0093] ゥサギ
    [0094] ヒ 卜 組換は次のよう にして行う ことができる。 すなわち、 ゥサ5 ギ腎細胞を培養してモノ レーヤーを形成し、 これにべクタ一 と してのワ ク シニアウ ィ ルスを感染せしめる。 次に、 リ ン酸 力 ルシゥ ム法によ り プラ ス ミ ド P13— HA— 7. 5 Ps - Be , P9一 HA - ATIP - Be又は pl3 -- HA - 7. 5 P N ― Beを ト ラ ンス フ エ ク 卜する。
    [0095] 次に、 これらのサ ンプルからウ イ ノレスを回収し、 RK13細胞 のモノ レー ヤ ー上にプレー · 卜 してプラ ー クを形成せしめる。 こ の表面にニヮ ト リ 赤血球をま く 。 目的とする組換が生じた ワ ク シニアウ ィ ルスはへマグルチニ ンを発現しない 〔 H A ( - ） 〕 ので赤血球を吸着しないがワ ク シニア ウ ィ ルスの野 性株は H A ( + ) であるためニヮ ト リ赤血球を吸着する。 こ れをマー カ ー と して組換ワ ク シニア ウ ィ ルスの候補株を選択 し、 これらのウ ィ ルスをク ロ ー ニ ングした後、 ゥ シ白血病に 罹患したゥ シの抗血清を用いて酵素抗体法によ り 、 ゥ シ白血 病表面抗原を発現している組換ウ ィ ルスを選択する。
    [0096] 次に、 上記のよ う にして得られた組換ウ ィ ルス、 及び対照 と しての野性株ウ ィ ルスを部分精製して二 ト ロセルロ ー ス膜 に吸着せしめ、 ァ イ ソ ト ―プラ ベルした表面抗原遺伝子 D N A とハイ ブリ ダィ ゼー シ ョ ンせしめる こ とによ り 、 前記 ゥ ィ ルスにゥ シ白血病表面抗原遺伝子が組込まれている こ と が確認される。
    [0097] また ·. 本発明の組換ウ ィ ルスをゥサギに接種し、 さ らに不 活性化されたゥ シ白血病ウ ィ ルスによ り追加免疫した場合、 ゥサギの血清中に gp60に対する抗体と思われる生成物が生産 されている こ とが確認される （第 10図及び第 11図） 。 又、 不 活性化されたウ ィ ルスの代り に、 抗原性を有するその部分を 使用することもできる。
    [0098] 以下の実施例において、 各緩衝液は次の組成を有する (1) 制限酵素緩衝溶液
    [0099] ( i ) 中塩濃度緩衝溶液 （PH 7. 5 )
    [0100] NaC ϋ 50mM
    [0101] Tris - C ί lOmM
    [0102] MgC I 2 10m«
    [0103] ジチオス レィ ト ール ImM
    [0104] ( ii ) 高塩濃度緩衝溶液 （PH 7. 5 )
    [0105] NaC ί lOOntM
    [0106]
    [0107] MgC ί z lOmM
    [0108] ジチオ ス レィ ト ール ImM
    [0109] ( iii ) Sma I緩衝溶液 (PH 8. 0 )
    [0110] C 20mM
    [0111] Tris · C ί lOmM
    [0112]
    [0113] ジチオス レィ ト ール ImM
    [0114] ( iv ) Nru I緩衝液 （pH 8. 0 )
    [0115] Tris - HC ί lOmM
    [0116] MgC £ z TmM
    [0117] KC & 150m
    [0118] 2 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ール 7mM
    [0119] B S A 100 '^/ m 2 - 1
    [0120] o 5
    [0121] (2) ラ ィ ゲー シ ョ ン緩衝溶液 （PH 7. 6 )
    [0122] Tr is ' C i 66mM MgC H 2 5mM
    [0123] 16
    [0124] ジチオ ス レィ ト ール 5πιΜ
    [0125] A T P ImM
    [0126] (3) ニ ッ ク ト ラ ンス レ ー シ ョ ン緩衝溶液 （PH 7. 2 )
    [0127] - 1
    [0128] 5
    [0129] Tris - C ί 50mi1
    [0130] 10 MgS04 lOmM
    [0131] ジチオス レイ ト 一ル 0. ImM ゥ シ血清ァ ルブ ミ ン 50
    [0132] (4) ェキ ソ ヌ ク レア ーゼ ΙΠ緩衝液 （PH 7. δ )
    [0133] Tris - HC i 50mM
    [0134] MgC ί z 5mM
    [0135] D T T 5mM
    [0136] B S A 50〃g mi
    [0137] (5) S I ヌ ク レア一ゼ緩衝液 （pH 4. 6 )
    [0138] 酢酸ナ ト リ ウ ム 50mM 酢酸亜鉛 ImM
    [0139] NaC & 250m
    [0140] B S A 50^ / mS> 実施例 1. プラス ミ ド PHA 13の作製 〔へマグルチ
    [0141] ニ ン （ H A ) 遺伝子のク ローニ ング〕 (第 1図及び第 2図）
    [0142] ワ ク シニアウ ィ ルス W R株のウ ィ ルスを精製し、 5 0 mM Tris -HC ^ (pH 7. 4 ) ( 1 mM EDTA 及び 0. 5 % ドデシル硫酸ナ ト リ ウム含有） 中に懸濁し、 プロティ ナーゼ Kを 250〜 1000 Z ^に加えて 3 7 'Cにて一夜ィ ンキュベ一 卜 した後、 锾衝 液で飽和されたフエノ ール ： ク ロ口ホルム （ 1 ： 1 ) で 3回 抽出し、 そしてェタノ —ルにより ウ ィ ルス D M Aを沈緵せし めた。 こ の D N Aを 1 0 mil Tris-HC ί (ΡΗ 8. 0 ) ( 1 mM BDTA 含有） に溶解し、 Hind HIによ り消化し、 ァガロ ースゲル電気 泳動により約 5 0 kbp の Hindm A断片を単離した。 この Hind IE A断片を、 高塩濃度緩衝液中で Sal I により消化し、 Hind M A断片の 3 ' 末端に存在する約 1. 8 kbp の Hind M - Sal I 断片を、 ァガロース電気泳動により单離した。
    [0143] 他方、 プラス ミ ド pCl! 13を Φ塩濃度緩衝液中で Hind ΠΙによ り、 次に高濃度緩衝液中で Sal I により消化して線状化し、 この線状化プラス ミ ドをァガロース電気泳動により单離した 前記の Hind ΠΙ — Sal I 断片と、 線状化プラス ミ ドとをライ ゲ一 シヨ ン緩衝液中で T4DNA リガーゼにより連結し、 この反 応混合物を用いて大腸菌 103を形質転換した。 個々のク ロ 一ンから迅速アル力 リ抽出法によりプラ ス ミ ドを抽出し、 制 限酵素分析により 目的とする構成を有するプラス ミ ドを選択 し、 PHA 13と命名した。 荬施例 2. 7. 5 白 プロモータ ーの合成
    [0144] (第 4図）
    [0145] ワク シニア ウ イ ノレスは独自の R N Aポ リ メ ラ 一ゼを持ち、 従って、 独自のプロモータ一配列をもつ。 ワ ク シニアウ ィ ル スの初期遺伝子でコ ー ドされる 7. 5 kd蛋白質のプロモータ ー は強力で、 組換えウ ィ ルスに組込まれた場合、 下流の構造遺 伝子が効率よ く 発現される こ とが分っている。 このプロモ ー タ ー領域はすでに、 塩基配列が決定されており、 それは、 第
    [0146] 7
    [0147] 3 図に示す通り である。
    [0148] 真核生物の TATAボ ッ ク スや、 原核生物のプリ ブノ ボ ッ ク ス に厳密に対応する配列はないが上図のよ う に T Aに富む配列 は存在する。 これらを参考に して、 TATA様の 2 つの配列と、 R N Aの転写開始点を舍むよ う に D N Aを合成した。 また、 後の実験の簡便化のために、 い く つかの制限酵素のサイ トを つけ、 末端には EcoR I の リ ンカ ーをつけた。
    [0149] 合成領域が長いため 2 つの領域に分け、 その各々 に相補的 な D N A とを合わせて 4本合成する こ とにし、 各々 VAC 1 , - 2 , 3 4 と命名 した。 これらを第 4 図に示す。
    [0150] これらの D N A単鎮は、 フ ォ ス フ ォ ア ミ ダイ ト法によ り D N A合成機 （Applied B i osy s tems社製） で、 各々合成し精 製の後、 連結した。
    [0151] 実施例 3. プラ ス ミ ド P9— 7. 5 Psの作製 （第 5 図）
    [0152] 得られた合成プロモ —タ ー と、 EcoR I で切断し、 線状化し た pCli 9 とをラ イ.ゲー シ ヨ ン緩衝液中で連結し、 こ の反応混 合物を用いて大腸菌 103を形質転換した。 得られたク ロー ンは各種制限酵素による分折によって正し い構成を有するプラス ミ ドであることを確認し、 P9 - 7. 5 Ps と命名した。 揷入されている方向は、 PCU 9 の lacZ遺伝子の D N Aの方向と同じであることがわかった。 さ らに、 これを ジデォキシ法により、 両端の EcoR I を除く領域の塩基配列を 決定した。
    [0153] 実施例 4. プラ ス ミ ド P13— Beの作製 （第 6図）
    [0154] B L Vゲノ ム遺伝子が挿入されたプラス ミ ド pBR-322- BLV を、. 中塩濃度緩衝液中で Ρνιι Π により消化し、 エタ ノ ール沈 澱の後、 さ らに高塩濃度緩衝液中で Xho I によって消化した, これらの Xho I -Pvu Π断片を、 ァガロース電気泳動によって 分離させ、 約 2. 1 Kbp の D N A断片を単離精製した。
    [0155] 次に、 これを Sma l緩衝溶液中で、 まず Sma' I によって完 全消化し、 予想されるバン ドが出現することを確認した後、 部分消化パイ ロ ツ 卜実験を行った。 Pvu E · Xho I - 2. lKbp DNA 1 に対して、 Sma I を 0. 1 , 0.075, 0.05= 0.025, 0.09と 5段階に変え、 3 ？ でで 3 0分消化させてみた。 その結果、 0.075 が適当であることがわかったのでこの濃度で部分消化 を行った。 生じた Sma I 断片をァガロース電気泳動によって 分離させ、 約 2 Kbp の D N A断片を単離精製した。
    [0156] 得られた Sma I — 2 Kbp DN 断片と、 線扰化プラ ス ミ ド CD 13― Sma 1 /BftP (フ ァ ルマシアノヾィ ォテクノ ロ ジ一 27— 4975-01)とをライゲーシヨ ン緩衝液中で -、 T4DNA リ ガーゼを 用いて連結しこの反応混合物を用いて、 大腸菌 107を形質 転換した。 得られたク ロー ンを各種制限酵素による分析によ つて正しい構成を有するプラス ミ ドを得、 これを P13— Beと 命名 した。 挿入されている方向は、 PCU 13の lacZ遺伝子の D N A方向と同じである こ とがわ力、つた。
    [0157] 実施例 5. プラス ミ ド P9— 7. 5 Ps - Beの作製
    [0158] (第 Ί 図）
    [0159] 前記のプラス ミ ド P13— Beを多量に増やした後、 これを中 塩濃度緩衝溶液中で EcoR I と 11 i nd ΙΠで消化し、 ァガロ ース電 気泳動で分離し、 精製した。 さ らにニ ン ク ' ト ラ ンス レ ー シ ョ ン緩衝溶液中でポ リ メ ラ ーゼ k 1 enow断片によ って D N Aの 突出した 3 ' 末端を埋め、 平滑末端に した。
    [0160] また、 前記ブラス ミ ド P9— 7. 5 Psを多量に増やした後、 高 塩濃度緩衝溶液中で Xba l で消化し、 同様にポ リ メ ラ ーゼ enow断片によ って平滑末端にした。
    [0161] こ の両者を、 ライ ゲ— シ ョ ン緩衝液中で T4DNA リ ガ一ゼを 用いて連結し .、 こ の反応混合物を用いて大腸菌 JM 107を形質 転換した。 得られたク 口—ンは、 制限酵素によ つてプラ ス ミ ドの構成および挿入の方向を調べ、 7. 5 K タ ンパク質プロモ 一タ ー と、 BLV-env の方向が一致している ものを p9 ' 7. 5 Ps 一 Beと命名 した。 さ らにこれをコ ロ ニ 一ノ、イ ブリ ダィ ゼー シ ヨ ンで、 Bい env の内部領域をプロ ーブと して調べ、 確認し た。
    [0162] 実施例 6. プラ ス ミ ド P13— HA— 7. 5 Ps - Beの作製
    [0163] (第 Ί 図）
    [0164] 前記プラ ス ミ ド P9— 7. 5 Ps— Beを多量に增やした後、 7. 5 K蛋白質プロモータ - と BLV-env とを含む領域を切り 出した c すなわち、 中塩濃度緩衝溶液中で Acc l で消化し、 ァガロー ス電気泳動で分離し、 精製した。 さらに、 ニック ト ラ ンス レ 一ショ ン緩衝溶液中で、 ポリ メ ラ—ゼ Klenow断片によって、 平滑末端にした。
    [0165] また、 へマグルチニン遺伝子を舍有するプラス ミ ド PHA 13 を、 中塩濃度緩衝溶液中で Acc l で消化し、 同様にボリ メ ラ ーゼ Klenow断片によって、 平滑末端にした。
    [0166] この両者を、 ライゲーショ ン緩衝液中で、 T4DNA リ ガーゼ を用いて連結し、 この反応混合物を用いて大腸菌 107を形 質転換した。
    [0167] こ う して得られたプラ スミ ド P13— HA— 7. 5 Ps— Beを含有 する大腸菌 Escherichia coli JM 107 - plSBe は微ェ研条寄 第 1286号 （FERM BP-1286)として工業技術院微生物工業技術 研究所 ， 茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 ， 日本 ， に 1987年 2月 10日に、 ブタ ぺス ト条約に基き国際寄託された。
    [0168] 実施例 7. ワ ク シニア ウ ィ ルスへの BLV-env 遺伝子の
    [0169] 組込み （第 8図)
    [0170] ゥサギ腎細胞株 RK13を直径 6 cmのシャ ー レにまいて、 3 了 で、 5 %C0z のもとで培養してモノ レーヤ ーを形成した- 次 に、 この培養細胞に、 ベク タ ー と してのワ ク シニア ウ ィ ルス L0-1株を、 .0. 1 moi の量で感染させ 1 時間置いた。 次に、 実 施例 6 において作製したプラ ス ミ ド pl3 - HA - 7. 5 P3— Beを リ ン酸カ ルシウ ム法 （Weir, J. P. ,等（1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, I£: 1210- 1214)によ り ト ラ ンスフ ヱ ク ト させた。 この培養物から、 凍結 ' 融解によ り ウ ィ ルスを培地 に放出させ、 ウ ィ ルスを回収した。
    [0171] RK 13細胞を直径 6 eraの シ ャ ― レに収容したィ — ダルの M E M培地中で 3 7 °cにて 2 4時間培養し、 モ ノ レーヤ ーを 形成させた。 次に、 この層上に、 上記のよ う に して回収した ウィ ルスをま き、 2 日間イ ンキュベー ト してプラ ークを形成 させた。 次に、 こ の層上にニヮ ト リ の赤血球をまき、 赤色に ならないプラ ーク 〔 H A (― ) を拾った。
    [0172] H A のウ ィ ルスをク ロ ー ニ ング した後、 これらの組 換え ワ ク シニア ウ ィ ルス候捕株が、 目的とする BLV - env 遺伝 子を有している こ とかどう かを調べるために ド ッ ト ブロ ッ ト ィ ブリ ダィ ゼー シ ョ ンを行なった。 上記の組換ワ ク シニア ウ ィ ルス候補株 2 0株と対象と してし 0- 1株と二 ト ロセル ス膜に吸着させ、 32 Pにより放射性ラ ベルした BLV- en V 遺伝 子 D N A とをハイ ブリ ダィ ズさせた。 その結果、 9株が目的 とする BLV-env 遺伝子を有している こ とがわかった。
    [0173] 実施例 8. 組換ヮ ク シニア ウ ィ ルスによ る Bい' -env
    [0174] 遣伝子の発現の確認
    [0175] 前記の候補株 9株について、 培養細胞中で実際に BLVenvを 発現しているかどう か調べるために、 ゥ ヱ スタ ン · ブロ ッ テ Λ ングを行なつた。
    [0176] RK 13細胞を直径 6 eraの シ ャ一レにまいてモ ノ レーヤ ーを形 成させ、 moi 1 (感染多重度） の量で組換ワ ク シニア ウ ィ ル ス候補株を感染 させ、 2 4時間培養し、 細胞を回収した。 これ らの 1 / 20量を S D S · ァ ク リ ルァ ミ ドゲルで電気泳動 し、 さ らにニ ト ロ セノレロ ー スぺ一 。一に ト ラ ンス フ ァ ーさせ た。 次に gp60に対するゥサギの抗体で処理した後、 パーォキ シダ—ゼで標識したャギの抗ゥサギ I g抗体を加えて反応さ せた。 その結果、 組換ワク シニアウィ ルス No. 3、 及び組換ヮ ク シニア ウ ィ ルス No. 1 6 の 2株が ΒΙ '-env をイ ンビ ト ロで発 現させている ことがわかった。 この結果を第 9図に示す。 こ の面中、 レー ン 1 〜 3 は組換ワク シニアウイノレス No. 3 、 レー ン 4 〜 （ は組換ワ ク シニア ウ イ ノレス No. 1 S 、 レー ン 7 はワ ク シニア ウィ ルス L0— 1株 （ネガテ ィ ブ対照） 、 レー ン 8 はコ ゥ モ リ の B L V感染細胞、 そしてレー ン 9 はヒ ッジの B L V感 染細胞の結果を示す。 なお、 組換ワ ク シニア ウ イ ルス Να 1 6 を L01 — 7. 5 Ps— Beとも称する。
    [0177] 実施例 9. 組換ヮクシニアウ ィ ルスによる BLV-env
    [0178] 遺伝子のィ ンビボ発現
    [0179] 実施例 8 においてィ ンビ ト 口での BLV- env 遺伝子の発現が 確認された組換ワ ク シニア ウ イ ルス ffe 3及び No. 1 6 について ィ ンビボでの発現を L 0 1 ウ イ ルス株 （ネガテ ィ ブコ ン ト 口 ール） と比較しながらゥサギにおいて確認した。
    [0180] 接種したウイルスの種類及び接種量は次の通りである。
    [0181] ゥサギ o. ウ ィ ルス株 接 1 対照ウ ィ ルス L 0 1 5 1 0 ( P F U ) 対照ウ ィ ルス L 0 1 5 X 1 0 7
    [0182] 3 組換ウ ィ ルス No. 1 6 5 I 0 7 4 組換ウ ィ ルス No. 1 6 5 1 0 7 5 組換ゥ ィ ルス No. 3 5 1 0 7 6 組換ウ ィ ルス No. 3 5 1 0 7
    [0183] 組換ウ ィ ルス No. 1 6 2 1 0 8
    [0184] 8 組換ウ ィ ルス No. 1 6 2 X 1 0 8 9 対照ウ ィ ルス L 〇 1 2 1 0 8
    [0185] ウ ィ ルスは全容 0. 5 と して 3 ケ所に皮内接種した。 1 週 間後に接種部位の発赤を測定したと こ ろ、 各々 1 0 wt程度の 赤点ができ ており 、 接種は成功したと判断された。 接種後 1 週間ごとに、 ゥサギ No. ；! 〜 6 は 1 2 週目まで、 ゥサギ No. 7 〜 9 は 1 0 週目まで採血してォク タ ロ ニー法 （北里研究所 ： 牛 白血病診断キ ッ ト） によ り抗体価を測定したが、 抗体は検出 されなかった。 また、 F L K細胞又は B L V ビ リ オ ンを抗原 と して用い る ウ ェ ス タ ン · ブロ ソ テ ィ ングにおいて も同様で め っ た 。
    [0186] 以上のごと く 、 組換ヮ ク シニア ウ ィ ルスによ つて液性免疫 は誘導されなかつたが、 ヘルパ一 T細胞が活性化されている 可能性は十分にある。 これを確認するため、 組換ワ ク シニア ウ ィ ルス No. 1 6及び L 0 1株 （対照） を 2 x 1 0 8 P F Uの 量で前記のごと く接種した No. 8 と No. 9 のゥサギに対して、 ゥ ィ ルス接種 1 0週後に B L V抗原 （牛白血病ウ ィ ルス持続感 染羊胎児腎細胞 HK - 1 1株を培養し、 そのウ イ ルス浮遊液を不 活性化したもの） を約 200 (抗原濃度は en v 抗原に対して 8単位の力-価） 接種して追加免疫し、 この抗原接種の後 1週 間おきに採血し、 ウェスタ ン · プロ ッティ ングによる測定を 行った。 ウェスタ ン ' プロ ッティ ング用抗原としてはゥ シ白 血病ゥィ ルスのビリ オ ンを使用した。 ゥサギの血清を 5 0倍 希釈して測定に供した。 追加免疫の 1 週間後及び 3週間後の 結果を第 1 0図に示す。 この図から明らかな通り、 組換ワ ク シニアウイノレス No. 1 6を接種されたゥサギの血清には gp60に 対する抗体と思われる生成物が存在するが L 0 1を接種され 'たゥサギからの血清中には対応する物質が検出されなかつた, 以上の結果、 組換ワク シニアウ ィ ルスのみを接種したゥサ ギ、 及び組換体でないワ ク シニアウイ ルスを接種後 B L V抗 原を接種したゥサギの血清中にはゥ シ白血病ウイ ルスのビリ ォンと反応する物質が検出されなかったが、 組換ヮク シニア ウ ィ ルスを接種した後、 不活化されたゥ シ白血病ゥィ ルスに より追加免疫したゥサギの血清中には gp60に対する抗体と思 われる物質が検出された。
    [0187] 第 i 1図には、 追加免疫の後、 3週間までの gp 60に対する 抗体の径時的変化を示す。 この図から明らかなように、 この 抗- gp 60抗体は、 追加免疫の時点では検出されず、 その後柽 時的に増加した。 ¾施例 10. A T I プロ モ ー タ ー の作製
    [0188] 5 1 0 8 個の Vero細胞 （ア フ リ カ ミ ド リ ザル腎臓由来細 胞） に牛痘ウ ィ ルス CPR0 6 株 （新潟大 · 巿撟康夫助教授よ り 入手） を moi 0. 2 に感染させて、 2 日後、 細胞変性が顕著に なった時期にウ ィ ルスを回収した。 こ の ウ ィ ルスをショ 糖密 度勾配遠心法で精製し、 約 3 呢のウ ィ ルスを得た。
    [0189] 得られた精製ウ ィ ルス 3 呢を 0. 5 %ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウ ム （ S D S )と 1 (πΜエチ レ ン ジァ ミ ン四酢酸ナ ト リ ウ ム (EDTA)
    [0190] 2
    [0191] の存在下で、 1 Ζ [^のプロ テ 5ア ーゼ Κ でー晚 3 7 て で消化 した。 除蛋白のためフ エ ノ ールノク ロ 口ホルムで 3 回抽出し、 ェチルエーテルで 3 回抽出した。 1 ノ 10量の 3 Μ酢酸ナ ト リ ゥムと 2 倍量のィ ソプロパノ 一ルとを加えて撹拌し、 凝集し た D Ν Αをガラ ス棒で捲き取った。 D N Aは T E 〔 1 0 mM ト リ ス ' 塩酸（Tr is-HC ） pH 8. 0 ； 1 mM EDTA j に溶かした。 D N A の収量は 180 であ っ た。
    [0192] 丄 0 の牛痘ウ ィ ルス D N Aを H i nd IDまたは Sa } I で
    [0193] 1 0 m.H Tris-HC H (PH 7. 5 ) , 6 0 NaC £ , 7 mM MgC ί 2 、 又は 1 0 mM Tris-HC £ (pH 7. 5 ) , 150m M NaC £ , 7 mM MgC ί z 中 3 7 。Cにて 120分間切断し、 それぞれ Hind fflで切断した pCU 18プラス ミ ド D N Aまたは Sa 1 I で切断した PUC 13フ。ラ ス ミ ド D N A と混合して、 6 6 mM Tr is- HC (pH 7. 5 ) , δ mil MgC £ 2 , 5 ジチオス レ ィ ト ー ル、 1 A T P中 T 4 リ ガーゼによ り 1 6 てにて 1 6 時間連結反応させた。 大腸菌株 JM 103又は Jil 109を上記の組換えプラ ス ミ ドで形質転換して、 牛痘ウ ィ ルス のゲノ ム D N A ラ イ ブラ リ 一と した。 組換えプ ラス ミ ドには、 1 kb〜 2 5 k bのゲノ ム D N A断片が含まれて いる。
    [0194] 牛痙ウ ィ ルス D N Aを含むプラ ス ミ ドをワ ク シニア ウ ィ ル ス感染細胞 （ C V — 1細胞） に導入 （ ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン） して、 A型封入体遺伝子の発現を抗 A型封入体抗体を用いて、 ウ ェスタ ンブ π ッテイ ングにより確認し、 A型封入体遺伝子 を舎む D N Aを同定した。
    [0195] まず 3 X 1 0 5 個の C V _ 1 細胞 （サルの.腎臓由来細胞） にワク シニアウ イ ルス W R株を mo i 5 0 にて感染させて 1 時 間置いた。 牛痙ウ ィ ルス D N Aを含むプラ ス ミ ドを、 前記の 大腸菌 2 πι の培養液からアルカ リ法により抽出し、 1 0 を ワ ク シニア ウ ィ ルス感染細胞に ト ラ ンス フ エ ク ト した。
    [0196] 3 0分間室温においた後、 5 %牛胎児血清を舍む培地を 3 m£ 加え、 5時間 3 7 で保温し、 一度培地を交換してから、 一 晩 3 7 'Cで保温した。 細胞懸濁液を超音波処理後、 S D S - ボリ アク リルア ミ ドゲルで電気泳動し、 これを抗 A型封入体 抗体を使用するウ ェスタ ンプロ ッティ ングに付した。 すなわ ち、 ゲル上の蛋白質を二 ト ロセルロースフ ィ ルターに電気的 に移した。 ニ ト ロセルロ ースフ ィ ルタ ーを 1 0 Tris- HC J2 ( H 7. 5 ) , 0.15M NaC ί . 5 %牛血清アルブ ミ ンで処理し た後、 抗 Α型封入体抗体と 1 0 mM Tris-HC & (PH 7. 5 ) , 0.15M NaC ^中で 1 時間 3 7 で反応させた。 さらにパーォ キシタ一ゼを結合させた抗ゥサギ I g G抗体を上記と同じ溶液 中で 3 7 で反応させた。 最後に 0.01%過酸化水素水、 0. 5 ノ の 4 —ク ロ 口ナフ トールを含む 1 0 Tris-HC ί (ρΗΤ.ο) 0.15M NaC 溶液で染色して、 A型封入体遺伝子の発現を確 認した。 その結果、 Sai l 2 2 kb断片に A型封入体遺伝子が 含まれている こ とが判明した。 前記ラ イ ブラ リ 一中のこの断 片を含むプラス ミ ドから Sal I によ り この断片を切り 出し、 さ らにこの断片を制限酵素、 Kpn I , Sph I , Pst I 、 又は Sac I で切断して、 対応する制限酵素により切断した pUC 18 又は plJC 19プラ ス ミ ドに連結する こ とにより組換えプラ ス ミ ド ρΒ 6 , PB20 , ΡΒ23 , pC 3 , PC 6 等を得、 これらのプラ ス ミ
    [0197] 2
    [0198] ドについて同様な操作を行なっ 7たと こ ろ、 Kpn I — Sph I 9. 1 kbp 断片 （フ。ラ ス ミ ド pB23) 、 Sac I — Sal I 8. 9 Kbp 断片 （プラ ス ミ ド PC 3 ) には A型封入体遺伝子全長が、 Sac I -- Sal I 6. 2 Kbp 断片 （プラ ス ミ ド pC 6 ) には A型封入体遺 伝子の一部が舍まれている こ とが判明した。
    [0199] 従って、 本発明においては、 A T I プロモータ ー源と して 上記のプラス ミ ドのいずれかを使用する こ とができ る。
    [0200] なお、 前記プラス ミ ド PB23を含有する大腸菌ェ シヱ リ シヤ コ リ (Escherichia col i) JM109- B 23が、 微ェ研菌寄第 8971 号 （FERM P - · 8971) と して 1986年 9 月 19日に工業技術院微生 物ェ研技術研究所 , 茨城県つ く ば巿東 1 丁目 1 番 3号 ， 日本、 に寄託され、 微ェ研条寄第 1459号（FERM BP - 1459) と して 1987年 9 月 1 日にブタぺス ト条約に基づ く 国際寄託に移管さ れた。
    [0201] 実施例 11. プラ ス ミ ド P13 C — G — 2 — 32の作製
    [0202] (第 12図）
    [0203] 実施例 10において作製したブラ ス ミ ド pC 6 を低塩濃度緩衝 液中で Sac I により消化した。 続いて高塩濃度緩衝液中で BamH【 によ 消化した。 さらにフヱノ ール抽出をし、 ェタノ 一ル沈鏺を行なつた後、 ェキソヌク レアーゼ m緩衝液中で、 ェキ ソ ヌ ク レア ーゼ IIによ り BamH I 部位から A T I プロモ一 ター領域に向かって約 3. 3 Kbp 除去した。 さ らに、 S 1 ヌク レアーゼ緩衝液中で S 1 ヌク レア —ゼを作用させ、 突出した 1本鎮を消化して平滑末端とした。 次に、 T4 DNAリ ガ—ゼを 用いて両末端を再連結して環化し、 この反応混合物を用いて 大腸菌 JM 109を形質転換した。 得られたク ロ ー ンからアル力 リ法によりプラ ス ミ ドを抽出し、 各種制限酵素にて分折し、 目的のプラス ミ ドを得、 これをプラス ミ ド pl3C— 6 ― 2 一 32 とした。
    [0204] 実施例 12. プラス ミ ド P18- ATI- pr。536の作製 （第 12図） 次のようにして、 A T I プロモーターの下流に外来遺伝子 を組み込むためのク 口 一二ング部位を導入した。
    [0205] ： ブラ ス ミ ド P13C— 6 - 2 - 32を高塩濃度緩衝液中で Taq I 及び EcoR I により '消化し、 さらに K I enowポリ メ ラ一ゼで処理 することにより末端を平滑化し、 A T ί プロモーターを含有 する D Ν Α断片を得た。 一方、 プラス ミ ド pUC 18を高塩濃度 緩衝液中で Hinc Hにより消化した。 両者を T4 DNAリ ガ—ゼに より連結し、 こ の反応混合物を用いて大腸菌 JM 109を形質転 換した,
    [0206] 得られたク ロー ンを各種制限薛素で分折し、 A T Γプロモ —ターの方向が Hindffl部位から EcoR I 部位に向かっているよ うなク ロー ンを得、 これをプラス ミ ド pl8-ATI-pro536とした 実施例 13. プラ ス ミ ド PA2- 9 の作製 （第 13図）
    [0207] pUC 18に組み込まれた A T I プロモーター領域のす ぐ下流 には A T Gが存在する。 .こ の A T Gは、 A T I 蛋白質遺伝子 の開始コ ド ンであるが、 こ こ に外来遺伝子を組みこむ場合に はこ の存在は不都合である。 こ のため、 こ の 丁 。を 丁 ノ に変換する操作を行った。
    [0208] プラ ス ミ ド pl8-ATI-pro536を中塩濃度緩衝液中にて Hind.DI で消化し、 さ らに高塩濃度緩衝液中で EcoR I にて消化した。 一方、 フ ァ ージ M13RF (複製型） D N Aを上記と同様に Hind
    [0209] E [及び EcoR I により消化した。 両者を T4 DN Aリ ガ一ゼにより 連結し、 こ の反応混合物を大腸菌 JM 109に ト ラ ンス フ エ ク ト した。 D N Aをアルカ リ法で抽出後、 各種制限酵素で分析し- 13-RFに A T I 遺伝子が組み込まれたこ と'を確認し、 これを .113 -ATI と した。
    [0210] M13-ATI を ト ラ ンス フヱク ト した大腸菌の培養上清より 、 フ ァ ージ（一本鎖 D N A )を回収した。 回収した一本鑌 D N A をエタノ ール沈穀により精製した。 次に、 Origonucleotide Si te-Directed Mutagenesis in !113と称— 3 るキ 'ン 卜 (Anglian Bio- technology Inc. 製） を用い、 プラ イ マー ヌ ク レオチ ド
    [0211] 〔 5 ' - AATAAATAGAGGTCACGAACC-3 ' ) を用いて部位特定変異 誘発を行った。 ヌ ク レオチ ドの変化をジデォキシ法により確 認し、 目的とする変異を有するプラ ス ミ ドを p A2 - 9 と命名し 実施例 14. プラ ス ミ ド PHAA2-9 の作製 （第 14図）
    [0212] プラ ス ミ ド pA2- 9 を中塩濃度緩衝液中で Hind HIによ り消化 し、 続いて高塩濃度緩衝液中で EcoR I にて消化した。 さらに これを Klenowポリ メ ラーゼ処理して、 末端を平滑化し EcoR I - Hind i [[断片を得た。
    [0213] 他方、 実施例 1 において得た P13HA の Nru l 部位に、 前記 PA2-9 からの末端を平滑化した断片を連結し、 反応混合物を 用いて大腸菌を形質転換した。 得られたクローンからプラス ミ ドを抽出し、 制限酵素で分折し、 A T I プロモータ—がへ マグルチニン遺伝子中に逆方向に揷入されているプラス ミ ド を得、 これを pH A2- 9 と命名した。
    [0214] 実施例 15. プラスミ ド p9— — ATIP— Beの 1乍製 （第 15図） 実施例 4において得たブラス ミ ド P13 - Beを中塩濃度緩衝 液中で Hind H [で消化し、 さ らに高塩濃度緩衝液中で EcoR I に て消化した。 得られた遺伝子断片を Klenowポリ メ ラ ーゼ処理 により末端を平滑化した。 一方、 実施例 14において得たブラ ス ミ ド を Sma l 緩衝液中で Sma ! にて消化した。 両 者を T4 リ ガーゼにて連結し、 この反応混合物で大腸菌を 形質転換した。 得られたクロ ー ンからプラスミ ドを抽出し、 これを各種制限酵素で分析し、 A T I プロモーターの下流に. A T I プロモータ—と同じ方向で B env遺伝子が組み込まれ ていることを確認した。 このプラ ス ミ ドを p9— HA— ATIP— Be と命名した。 このプラス ミ ドを舍有する Eschcerichia col i Τβ— P9— HA— ATIP— Beは、 1988年 月 8日に、 工業技術院微 生物工業技術研究所、 茨嫁県つ ぐば市東 1 丁目 1番 3号、 日 本、 に FERH BP— 1了 08としてブタぺス ト条約に基き国際寄 託された。 荬施例 16. ワ ク シニア ウ ィ ルスへの BLV- em' 遣伝孑の 組込み
    [0215] ゥサギ腎細胞株 RK13を直径 6 eraのシ ャ ー レにまいて、 3 7 、 5 ¾C0Z の も とで培養してモノ レ ー ヤ ーを形成した。 次 に、 この培養細胞に、 ベク タ ー と してのワ ク シニアウ ィ ルス L0- 1株を、 mo i 0. 1 の量で感染させ 1 時間置いた。 次に、 実 施例 15において調製したプラス ミ ド p9— HA— ATIP— Beを、 リ ン酸カ ルシウ ム法 （Weir, J. P. , ^ (1982)Proc. Natl . cad. Sci. USA, 7_9, 1210-1214)によ り ト ラ ンス フ ヱ ク 卜 させた , この培養物から、 凍結 · 融解によ り ウ ィ ルスを培地に放出さ せ、 ウ ィ ルスを回収した。
    [0216] RK13細胞を直径 6 onのシ ャ ー レに収容したィ —ダルの
    [0217] M E M培地中で 3 7 で にて 2 4時間培養し、 モ ノ レーヤ ーを 形成させた。 次に、 こ の層上に、 上記のよ う に して回収した ウ イ ノレスをま き、 2 日間イ ンキュベー ト してプラ ークを形成 させた。 次に、 こ の層上にニヮ ト リ の赤血球をまき、 赤色に ならないプラ ーク 〔 H A ( - ） 〕 を拾った。
    [0218] こ う して、 3 2個の候補ウ ィ ルス株を得た。
    [0219] 実施例 17. 組換ワ ク シニア ウ ィ ルスによ る BLV - e n V - 遺伝子の発現の確認
    [0220] 前記の候補株 3 2 株について、 培養細胞中で実際に BLVenv を発現しているかどう か調べるために、 ク ロ ーニ ング後、 ゥ エ スタ ン ' プロ ッ テ ィ ングを行なっ た。
    [0221] RK13細胞を直径 6 cmの シ ヤ ー レにまいてモ ノ レー ヤ ーを形 成させ、 mo i 1 の量で組換ワ ク シニア ウ ィ ルス候補株を感染 させ、 2 4時間培養し、 細胞を回収した。 これらの 1 /20量 を S DO 24 1 C LO 6 S ' アク リルア ミ ドゲルで電気泳動し、 さ らにデユラ ホアペーパー （ミ リ ボア製） に ト ラ ンスファ 一させた。 次に gP60に対する抗体で処理した後、 パーォキシダ—ゼで標識し たャギの抗ゥサギ I g抗体を加えて反応させた。 その結果、 組換ヮク シニア ウ ィ ルス No. 2 9株 （m0— ATIP— Be株とも称す る） が BLV- env をイ ンビ トロで発現させていることがわかつ o
    [0222] 3
    [0223] この結果を第 1 8図に示す。 2
    [0224] 実施例 18. 組換ワ ク シニアウ ィ ルスによる BLVenv
    [0225] 遺伝子のィ ンビボ発現
    [0226] 実施例 1 7 においてィ ンビ ト 口での BLVenv遺伝子の発現が 確認された組換ワ ク シニア ウ ィ ルス ΐ¾ 2 9 について、 イ ンビ ボでの発現を m 0ウィ ルス株 （ネガティ ブコ ン ト ロール） と 比較しながらゥサギにおいて確認した。
    [0227] 接種したゥィ ルスの種類及び接種量ば次の通りである。 ゥサギ Να ウ ィ ルス株 接 種 _量 — 組換えゥ ィ ルス No. 2 9 1 X 1 0 8 (PFU)
    [0228] 1 X 1 0 8
    [0229] 1 1 0 8 対照ゥ ィ ルス m 0 1 X 1 0 8
    [0230] 1 x 1 0 8 1 1 0 8 ウ ィ ルスは全容 0. 5 と して 2 ケ所に皮内接種した。 1 週 間後に接種部位の発赤を測定したと こ ろ、 各々 1 0 程度の 赤点ができており 、 接種は成功したと判断された。
    [0231] 実施例 19. プラ ス ミ ド P2401の作製
    [0232] Venktesan, S. 等、 Cel 1 , 25, 80.5-813 (1981) の方法に従 つて 7. 5 K蛋白質のプロモータ—を含有する 0.26kbp の Rsa l -- Hinc II断片を得、 これを pUC の Hinc II部位に揷入する こ と により プラス ミ ド P2401 を得た。
    [0233] 3
    [0234] 実施例 3
    [0235] 20. プラ ス ミ ド P2401 - 7. 5 P N - Beの作製
    [0236] (第 16図）
    [0237] 7. 5 Kdプロモータ ーが挿入されているプラス ミ ド P2401を . Sma I 緩衝液中で Sma I によ り消化した。 さ らにフヱノ ール 抽出にて酵素を不活性化したのちエタ ノ ー ル沈澱を行った。
    [0238] また、 実施例 4 において得たプラ ス ミ ド pl3— Beを中塩濃 度锾衝液中で EcoR I 及び Hi nd HIによ り消化した。 この EcoR I - H i nd ffl断片をァガロ ース電気泳動によ り分離し、 約 2. 0 Kbp の D N A断片を単離精製した。 さ らにポ リ メ ラ ーゼ K】 enow断 片によ り D N Aの突出した 3 ' 末端を埋め平滑末端と した。
    [0239] 上記の Sma I で消化したプラ ス ミ ド p2401と BLV-env 遺伝 子を舍有する 2 Kb断片とを T4 DN リ ガ―ゼを用いて連結し、 この反応混合物を用いて、 大腸菌 T B - 1 を形質転換した。 得られたク ロ ー ンを各種制限酵素によ って分折し、 BL V - en V 遺伝子が 7. 5 Kdプロ モ ータ ー と同じ方向に挿入されている こ とを確認し、 P2401— 7. 5 P N — Beと命名 した。 実施例 21. プラス ミ ド P13— HA— 7. 5 P H 一 Beの作製
    [0240] (第 17図）
    [0241] 実施例 20において得たプラス ミ ド P2401 - 7. 5 P N —Beを 中塩濃度緩衝液中で Hind ΠΙ及び EcoR I により消化し、 7. 5 Kd プロモータ一に連結された BLVenv遺伝子断片を得た。 この約 2. 2 KbP の断片をァガロ—ス電気泳動により単離 · 精製した- さらに、 ポリ メ ラ一ゼ Kl enow断片によって D N A断片の突出 した 3 ' 末端を平滑末端とした。
    [0242] 他方、 実施例 1 において得 3た 4ブラスミ ド pHA 13を中塩濃度 緩衝液中で Acc I により消化して線状化し、 フエノ ール抽出 により酵素を失活せしめた後エタノ一ル沈殺を行つた。
    [0243] 次に、 前記の 7. 5 Kbプロモータ—及び BLVenv遺伝子を含有 する 2. 2 Kb断片と、 線状化されたプラス ミ ド pHA 13とを
    [0244] T4 Mkリガ一ゼにより連結し、 この反応混合物を用いて大腸 菌 TB- 1 を形質転換した。
    [0245] 得られたクロー ンを各種制限酵素により分折し、 5 Kdプ ロモータ—— BUenv遺伝子の揷入を確認し、 この得られたプ ラス ミ ドを P13— HA— 7. 5 P κ — Beと命名した e このプラ ス ミ ドを舍有する Escherichia col i TB - pl3 - HA - 7. 5 P N -Beは、 1988年 2月 8日に、 工業技術院微生物工業技術研究 所、 茨城県つく ば巿東 1 丁目 i番 3号に FERM BP - 1 7 0 3 としてブタぺス ト条約に基き国際寄託された。
    [0246] 実施例 22. ワク シニア イ ルスへの& - E N V 遺伝子の
    [0247] 組込み
    [0248] ゥサギ腎細胞株 RK13を直径 6 onの シ ャ ー レにまいて、 3 7 、 5 %C0z のも とで培養しモノ レーヤーを形成した。 次に この培養細胞に、 ベクタ ー と してのワ ク シニア ゥ ィ ルス L0-1 株を、 moi 0. 1 の量で感染させ 1 時間置いた。 次に、 実施例 21において作製したプラ ス ミ ド P13— HA - 7. 5 P N - Beを、 リ ン酸カルシウム法 （Weir, J. P. ,等 （1982) Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 79., 1210-1214)により ト ラ ン ス フ エ ク ト させた。 この培養物から、 凍結 · 融解によ り ウ ィ ルスを培地 に放出させ、 ウ ィ ルスを回収した。
    [0249] RK13細胞を直径 6 cmのシヤ ー レに収容したィ 一ダルの M E M培地中で 3 7 てにて 2 4時間培養し、 モノ レーヤーを 形成させた。 次に、 この層上に、 上記のよ う にして回収した ウ ィ ルスをまき、 2 日間ィ ンキュベー ト してプラ ークを形成 させた。 次に、 この層上にニヮ ト リ の赤血球をまき、 赤色に ならないプラ ーク 〔 H A (—） 〕 を拾った。
    [0250] その結果、 2 3 個の候補ウ ィ ルス株を得た。
    [0251] 実施例 23. 組換ヮ ク シニアウ ィ ルスによる B env
    [0252] 遺伝子の発現の確認
    [0253] 前記の候補株 2 3株について、 培養細胞中で実際に BLVenv を発現しているかどう かを調べるために、 ク ロ ーニ ングの後、 ウ ェスタ ン - ブロ ッ テイ ングを行なった。
    [0254] RK13細胞を直径 6 cmのシ ャ ー レにまき、 モノ レーャ —を形 成させ.、 mo i 1 の量で組換ワ ク シニアウ ィ ルス候捕株を感染 させ、 2 4時間培養し、 細胞を回収した。 これらの 1 20量 を S D S · ア ク リ ルア ミ ドゲルで電気泳動し、 さ らにデユ ラ ポアペーパー （ ミ リ ポア製） に ト ラ ンスフ ァ ーさせた。 次に gp60に対する抗体で処理した後、 パーォキシダ—ゼで標識し たャギの抗ゥサギ I g抗体を加えて反応させた。 その結果、 組換ワ ク シニアウ ィ ルス No. 1株 （m O— 7. 5 P N —B eとも称す る） が BLVe n vをィ ンビ ト 口で発現させていることがわかった この結果を第 1 8図に示す。
    [0255] 実施例 24. 組換ワク シニアウイルスによる Bし V en v
    [0256] 遺伝子のィ ンビボ発現
    [0257] 実施例 23においてイ ンビ ト ロでの BL Venv遺伝子の発現が確 認された組換ワ ク シニア ウ ィ ルス No. 1 について、 ィ ンビボで の発現をゥサギにおいて確認した。
    [0258] 接種したウイルスの種類及び接種量は次の通りである。 ゥ サギ o. ゥ ィ ルス株 接 種 量 組換えウ ィ ルス No. 1 1 1 0 8 (P FU)
    [0259] ゥィ ルスは全容 0. 5 m と して 2 ケ所に皮内接種した。 1週 間後に接種部位の発赤を測定したところ、 各々 1 0 urn程度の 発赤ができており、 接種は成功したと判断された。
    [0260] 接種後 1週間ごとに、 ゥサギの耳静脈より採血し、 その血 清を 5 0倍希釈したものを用いて、 B L V ビ リ オ ンを抗原と したウェスタ ン · ブロ ッティ ングを行なった。 6週目の血清 についての結果を第 1 9図に示す。 gp60に特異的なバン ドが 3 匹のラ ビ ッ ト の血清に認め られた。 希釈率を 5 倍あるいは 1 0 倍にする こ とによ って、 よ り 明確なバン ドを得る こ とが できた。 1 4 週目の血清についても同様の実験を行なったが 同じ結果であつた。
    [0261] ウ ィ ルス接種後 1 4週目に 0. 4 % —プロ ピオ ラ ク ト ンで 不活化させた約 1 1 0 7 個の組換ワ ク シニア ウ ィ ルス感染 細胞を筋注した。 こ の追加免疫 3 週後のゥ ュス タ ンブロ ッ テ ィ ングの結果が第 2 0 図で、 g p 60に特異的なバン ドが強ま つ
    [0262] 3
    [0263] ている こ とがわかる。 【f， 産業上の利用可能性
    [0264] 本発明により 、 新しいタ イ プのゥ シ白血病ウ イ ノレス ヮ ク チ ンが提供され、 これは特に畜産及び酩農の分野において有用 である。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. ワク シニアゥィ ルス遺伝子にゥ シ白血病ゥ ィ ルスの表 面抗原遺伝子が組み込まれており、 ゥ シ白血病ゥィルスの表 面抗原を発現する ことができる組換ウ ィ ルス。
    2. 前記ゥ シ白血病ウィ ルスの表面抗原がワク シニアウイ ルス遺伝子のへマグルチ二ン遺伝子領域に組み込まれている 請求の範囲第 1項に記載の組換ウ ィ ルス。
    3. 前記ゥ シ白血病ウ ィ ルスの表面抗原遺伝子の上流に 7. 5 K蛋白質のプロモータ —及び牛痘ウ ィ ルスの A型封入体
    ( A T I ) 遺伝子のプロモーター.から成る群から選択された プロモーターを有する請求の範囲第 1 項に記載の組換ウイル ス。
    4. 前記ゥ シ白血病ゥィ ルスの表面抗原の遺伝子及び該遺 伝子のための制御配列以外の遺伝子部分全部又は大部分がヮ ク シニアウイ ルスの遺伝子に由来する請求の範囲第 1 項に記 載の組換ウ ィ ルス。
    5. ワク シニアウイ 几 ス遺伝子にゥ シ白血病ゥ ィ ルスの表 面抗原遺伝子が組み込まれており、 ゥ シ白血病ウ ィ ルスの表 面抗原を発現することができる組換ゥィルスの製造方法であ つて、
    ( 1 ) ワク シニアウイ ルス遺伝子由来のへマグルチニン遺伝 子を舍有する D M A断片をク ローニングベクターに揷入して へマグルチ二ン遺伝子含有べク タ一を用意し ；
    (2) 前記へマグルチニン遺伝子含有ベクタ ー中のへマグル チニ ン遺伝子中に、 ゥ シ白血病ウ ィ ルスの表面抗原遣伝子及 び該遺伝子のためのプロモーターを揷入してゥ シ白血病ゥ ィ ルスの表面抗原遺伝子舍有ベクタ—を調製し ； そして
    (3) 前記表面抗原遺伝子含有ベクター中のへマグルチニ ン 遺伝子領域と、 ワ ク シニア ウ ィ ルス遺伝子のへマグルチニ ン 遺伝子領域との間の相同性組換によ り該ワ ク シニア ウ ィ ルス 遺伝子のへマグルチニ ン遺伝子領域に前記ゥ シ白血病ウ イ ル ス の表面抗原遺伝子を該遺伝子のためのプロ モ ータ ーと共に 組み込む ；
    段階を含んで成る方法。
    6. ワ ク シニアウ ィ ルス遺伝子にゥ シ白血病ウ ィ ルスの表 面抗原遺伝子が組み込まれており、 ゥ シ白血病ウ ィ ルス の表 面抗原を発現することができる組換ウ ィ ルスを哺乳類に接種 するこ とを特徴とする、 哺乳類をゥ シ白血病ウ ィ ルスに対し て免疫する方法。
    7. ワ ク シニアウ ィ ルス遺伝子にゥ シ白血病ウ ィ ルス の表 面抗原遺伝子が組み込まれており、 ゥ シ白血病ウ ィ ルスの表 面抗原を発現するこ とができる組換ゥィ ルスを哺乳類に接種 し、 次に不活性化されたゥ シ白血病ウ ィ ルス又は抗原性を有 するその部分を接種するこ とを特徴とする、 哺乳類をゥ シ白 血病ウ ィ ルスに対して免疫する方法。
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    公开号 | 公开日
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-08-25| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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